随着分子生物学研究逐步普及,凝胶成像系统在国内的需求在不断增长不管是什么用途,凝胶成像系统的组件都是相似的。都有一个拍摄系统、一个带有特殊光源的暗箱与获取和分析凝胶图片的软件组成。”但是,大部分凝胶成像系统提供了不同的产品特性来满足不同科学研究的需要。快速发展的电子技术、光学技术和成像分析软件使成像操作越趋人性化。
原理及应用
凝胶成像系统是一个集观察、拍摄和分析凝胶于一体的凝胶分析系统。使用该系统可以对凝胶进行定量和定性分析。
凝胶成像系统是实验室常用的一种仪器,其应用范围极其广泛。总的来说,凝胶成像系统可以用于:蛋白质、核酸、多肽、氨基酸、多聚氨基酸等其他生物分子的分离纯化结果作定性分析;确定生物分子的分子量;用于生物分子的定量分析。
样品在电泳凝胶或者其他载体上的迁移率不一样,以标准品或者其他的替代标准品相比较就会对未知样品作一个定性分析。这个就是图像分析系统定性的基础。根据未知样品在图谱中的位置可以对其作定性分析,就可以确定它的成份和性质。
样品对投射或者反射光有部分的吸收,从而照相所得到的图像上面的样品条带的光密度就会有差异。光密度于样品的浓度或者质量成线性关系。根据未知样品的光密度,通过于已知浓度的样品条带的光密度指相比较就可以得到未知样品的浓度或者质量。这就是图像分析系统定量的基础。采用最新技术的紫外透射光源和白光透射光源使光的分布更加均匀,最大限度的消除了光密度不均造成的对结果的影响。
凝胶成像系统具体可以用于哪些实验分析?
具体从使用分析的角度来看,凝胶成像系统可以应用于分子量计算,密度扫描,密度定量,PCR定量等生物工程常规研究。
1、分子量定量
对于一般常用的DNA胶片,利用分子量定量功能,通过对胶上DNAMarker条带的已知分子量注释,自动生成拟合曲线,并以它衡量得到未知条带的分子量。通过这种方法所得到的结果较肉眼观察估计要准确很多。此方法也适用于对PAGE蛋白胶条带的分子量测定。
2、密度定量
一般常用的测定DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)浓度的方法是紫外吸收法,但它只能测定样品中的总核苷酸浓度,而不能区分各个长度片段的浓度。利用凝胶成像系统和软件,先将DNA胶片上某一已知其DNA含量的标准条带进行密度标定以后,可以方便的单击其他未知条带,根据与已知条带的密度做比较,可以得到未知DNA的含量。此方法也适用于对PAGE蛋白胶条带的浓度测定。
3、密度扫描
在分子生物学和生物工程研究中,常用到的是对蛋白表达产物占整个菌体蛋白的百分含量的计算。传统的方法是利用专用的密度扫描,但利用生物分析软件,结合白光照射的凝胶成像获取图片,就能完成此项工作。
4、PCR定量
PCR定量主要是指,如果PCR实验扩增出来的条带不是一条,那么可以利用软件计算出各个条带占总体条带的相对百分数。就此功能而言,与密度扫描类似,但实际在原理上并不相同。PCR定量是对选定的几条带进行相对密度定量并计算其占总和的百分数,密度扫描时对选择区域生成纵向扫描曲线图并积分。
分类
1、普通凝胶成像分析系统
适用于对蛋白凝胶电泳(考马斯染色,银染)等可见光样品,以及DNA/RNA(EB、TLCplates、SYBRGreen)等紫外;进行图象采集并进行定性和定量分析;
2、化学发光成像分析系统
适用于化学发光/紫外光/可见光凝胶成像分析系统,如ECL、ECLPLUS、Southern、CDPStar、CSPD、Northern和Western杂交的化学发光等各种化学发光暴光后的样品检测
3、多色荧光成像分析系统
适用于荧光/化学发光/可见光凝胶成像分析系统,如:EB、TLCplates、GFPplates、SYBRGreen、SYBRGold、SYBRSafe、SyproRed、SyproOrange、TexasRed、RhodamineRed、Fluorescein、DeepPurple、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、荧光板等的样品检测;
4、多功能活体成像分析系统
适用于生物发光(bioluminescence)与荧光(fluorescence)两种技术。生物发光是用荧光素酶(luciferase)基因标记细胞或DNA,而荧光技术则采用荧光报告基团(GFP、RFP),或Cyt及dyes等荧光染料进行标记。
结构
凝胶成像系统的基本骨架包含:CCD相机,暗室和分析软件。其不仅对琼脂糖凝胶进行成像,还适用于蛋白胶、发荧光的胶、印迹膜和菌落平板等应用。在WesternBlot方面,高性能的CCD分子成像系统能与胶片媲美。
CCD
CCD是电荷耦合器件(ChargeCoupledDevice)的英文名称缩写,是一种光电转换器件,是凝胶图像系统的核心部件。有人把数码相机的像素看得很重,但比较之后发现,有些万、万像素的相机拍出来的片子没有像素的机子拍出来的好,这是为什么?
衡量CCD好坏的指标,有分辨率,CCD尺寸,动态范围,灵敏度,量子效率,信噪比等,其中像素数以及CCD尺寸是重要的指标。CCD感光器件的面积越大,捕获的光子越多,感光性能越好,信噪比越低。
1、CCD尺寸
为了方便您更了解CCD的大小,现列举目前市场上所应用的CCD规格如下:
1英寸——靶面尺寸为宽12.7mm*高9.6mm,对角线16mm。
2/3英寸——靶面尺寸为宽8.8mm*高6.6mm,对角线11mm。
1/2英寸——靶面尺寸为宽6.4mm*高4.8mm,对角线8mm。
1/3英寸——靶面尺寸为宽4.8mm*高3.6mm,对角线6mm。
1/4英寸——靶面尺寸为宽3.2mm*高2.4mm,对角线4mm。
CCD的分辨率由低到高:从45万左右,万左右,万左右,万左右,万左右,万左右,万左右,甚至还有更高的,根据CCD的温度有可以分为常温CCD相机和制冷CCD相机,制冷CCD:热或者暗电流对于CCD都是噪音,噪音在冷CCD基本都可以被深度致冷的Peltier消除。在曝光超过5-10秒,CCD芯片就会发热,没有致冷设备的芯片,“热”或者白的像素点就会遮盖图像,图像到处可见雪花。CCD结构设计、数字化的方法等都会影响噪音的产生。当然通过改善结构、优化方法,同样能减少噪音的产生。
制冷CCD的适用性:荧光及化学发光本身较弱,所以对CCD噪音的降低要求很高,应选用高分辨率数字冷却CCD相机结合高通透镜头系统,使其能够捕获到信号极其微弱的荧光及化学发光样品图像,并且能够最大程度的降低噪音,减少背景,提供出色的图像清晰度。另外可选激发光源及多位滤镜轮扩大了荧光/化学发光成像的应用范围。所以一般在荧光及化学发光观察时需要选择制冷CCD。所以制冷CCD相机绝对是高端分子影像成像分析系统的未来的发展趋势和必须要求。
2、分辨率
分辨率的大小和像素值是分不开的,像素指得是CCD能分别的最小的感光元件,我们平时说的多少万像素就是这些感光元件的个数了。所以一般来讲像素越多,成像也就越清晰细腻,当然这其中还要受许多因素限制。高像素也不一定是好的CCD,其原因就是像素大小(PixelSize),也是很重要的因素,相同数目的像素,排列越密集,像素之间就越容易出现电流干扰,容易出现"噪点"等干扰成像质量的现象出现。由于制造工艺的限制,增加尺寸,成本将会以几何级数提高。
现在大部分厂家的CCD为了提高图像的灵敏度,会使用像素合并的技术,那么像素合并的意义是什么呢?像素合并是一种非常有用的功能,它可被用来提高像素的大小和灵敏度。
3、动态范围值
动态范围表示在一个图像中最亮与最暗的比值。灰阶表示在一种表征光亮度的方法,bit值越高能分出的细微差别越大。值得一提的是,目前来说,市场上主流的凝胶成像的CCD以12bit为主,16bit的仪器一般情况下,分辨率均在万像素左右,对于真正的16bit,而像素值又近万的CCD是非常少见的。对动态范围进行量化需要一个运算公式,即动态范围值=20log(welldepth/readnoise),其中Welldepth代表是满井电子,是CCD饱和时能接受的电子信号总值,readnoise是读出噪声(以电子数来表示),每个CCD在读数的过程中都会产生噪声,噪声越小,监测灵敏度越高。其中满井电子与CCD的bit值是相关的,通常下,bit值越高,满井电子的数值越大。动态范围的值越高CCD性能越好.
4、量子效率
CCD的量子效率也称像素灵敏度,指在一定的曝光量下,像素势阱中所积累的电荷数与入射到像素表面上的光子数之比。不同结构的CCD其量子效率差异很大。比如光子中积累到像素势阱中的电荷数是50个,则量子效率为50%(photons=50electronsmeans50%efficiency)。值得注意的是CCD的量子效率与入射光的波长有关。
5、信噪比
暗电流是导致CCD噪音的很重要的因素。暗电流指在没有曝光的情况下,在一定的时间内,CCD传感器中像素产生的电荷。我们在做化学发光检测的时候,需要的曝光的时候比较长,这样导致CCD产生较多的暗电流,对图像的质量影响非常大。通常情况下通过降低CCD的温度来最大限度的减少暗电流对成像的影响。暗电流与温度的关系,CCD产生的暗电流随着温度下降而减少,但是在-23℃下曲线开始趋于平缓,由此可以看出温度并非需要无休止的降低的。所以在选择冷CCD时,温度在-25℃下一般就可以达到要求了。
有的CCD是在图像最终生成后,通过软件去背景来扣除暗电流,对于信号远远强于背景的有一定效果,但是对于弱信号处理过程中会产生越来越多的错误。
光学镜头
光学镜头是机器视觉系统中必不可少的部件,直接影响成像质量的优劣,影响算法的实现和效果。光学镜头规格繁多,有时不免头晕。光学镜头从焦距上可分为短焦镜头、中焦镜头,长焦镜头;从视场大小分有广角、标准,远摄镜头;结构上分有固定光圈定焦镜头,手动光圈定焦镜头,自动光圈定焦镜头,手动变焦镜头、自动变焦镜头,自动光圈电动变焦镜头,电动三可变(光圈、焦距、聚焦均可变)镜头等。
滤光镜片(荧光)
数据传输
支持的传输速率越高越好
软件功能
凝胶成像仪都是由硬件和软件所组成,两者是不可分割的。硬件设备再好,如果不配上好的软件,也无法发挥它应有的功能。作为凝胶成像系统软件功能和用途都基本相似,这里我们介绍一下最